Sitokrom P-4501A1 (CYP1A1) gen diatur oleh beberapa faktor yang bekerja termasuk 4 S polycyclic aromatik hidrokarbon (PAH)-binding protein, yang baru-baru ini diidentifikasi sebagai N-methyltransferase glisin (GNMT). Peran GNMT sebagai 4 S PAH-binding protein dalam menengahi induksi sitokrom P-4501A1 telah diteliti lebih lanjut. GNMT cDNA, yang clone menjadi vektor pMAMneo berisi virus Rous sarcoma promotor dan gen resistensi neomisin, itu secara stabil transfected ke ovarium D422 hamster cina (CHO) sel. Beberapa klon positif dipilih oleh reverse transcription-polymerase chain reaction dan diuji untuk ekspresi protein rekombinan. Analisis Blot Western menunjukkan tingkat ekspresi signifikan dari 4 S protein dalam sel CHO transfected stabil (CHO-GNMT). Persiapan Cytosolic dari CHO-GNMT menunjukkan tingginya benzo [a] pyrene (B [a] P) yang mengikat tapi tidak 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioksin (TCDD) yang aktif mengikat bila dibandingkan dengan klon transfected dengan faktor pMAMneo saja (CHO-neo) atau sel parental CHO. TCDD tidak menginduksi ekspresi gen CYP1A1 dalam sel-sel ini. B [a] P diperlakukan CHO-GNMT, diketahui 4 S protein, juga menunjukkan CYP1A1 protein melalui Western blotting dan memprlihatkan ethoxyresorufin-O-deethylase; baik CHO-neo atau sel parental CHO positif untuk setiap tindakan tersebut.
Polycyclic aromatic hydrocarbon seperti B [a] P1, 3-methylcholanthrene, dan TCDD adalah polutan lingkungan yang mendatangkan berbagai beracun, teratogenic, dan karsinogenik yang diterima oleh hewan. Selain itu, bahan ini adalah inducers ampuh biotransformation terhadap reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh sitokrom P-450 yang tergantung monooxygenases, keluarga super isozymic hemoproteins terdiri dari lebih dari 12 kelompok gen. Isozymes ini menampilkan kekhususan memetabolisme substrat endogen baik substrat dan xenobiotics untuk elektrofilik derivatif, beberapa di antaranya dapat berinteraksi dengan DNA, sehingga berpotensi mengaktifkan protooncogenes atau menonaktifkan gen pemicu tumor.
Suatu sitokrom P-450 dipicu oleh B [a] P, 3-methylcholanthrene, atau TCDD adalah CYP1A1, yang sebagian bertanggung jawab atas pengaktifan untuk peralihan karsinogenik PAHs. Induksi ini diperantarai oleh reseptor seperti reseptor Ah (atau dioxin reseptor, 8 S protein). Mekanisme media reseptor Ah ditandai yang terbaik dan paling luas diterima PAH-model untuk ekspresi induksi CYP1A1. Setelah ligan mengikat, Ah reseptor yang mengalami transformasi bergantung pada suhu disertai oleh translokasi ke nukleus tempat reseptor ligan mengikat cis-elemen kompleks tertentu (juga dikenal sebagai XREs dan Dres) terdapat di 5'-daerah dari CYP1A1 dan beberapa gen lain dalam gen pengisi Ah. Hasil dari interaksi tersebut adalah aktivasi transkripsi gen responsif Ah.
Bukti yang telah dipublikasikan menunjukkan bahwa tikus induksi CYP1A1 setelah pengobatan dengan PAHs, seperti B [a] P atau B [e] P, mungkin memerlukan reseptor-Ah jalur independen dimediasi oleh protein reseptor cytosolic lain, 4 S PAH - binding protein. Baik Ah reseptor dan 4 S PAH-binding protein mengikat ligan berbeda menunjukkan kekhususan, dengan 3-methylcholanthrene berinteraksi dengan keduanya.
Peruntunan parsial dari 33-kDa protein 4 S menunjukkan identitasnya sebagai GNMT (S-adenosylmethionine: glisin N-methyltransferase, EC 2.1.1.20). Berdasarkan sejumlah kriteria, GNMT dan 4 S PAH-mengikat protein yang ditampilkan untuk menjadi satu dan menjadi protein yang sama (34).
Kami menyimpulkan GNMT terlibat dalam aktivasi transkripsional dari CYP1A1, sehingga memberikan alternatif, Ah reseptor-mempunayi jalur tersendiri untuk modulasi ekspresi CYP1A1 oleh tertentu PAHs, seperti B [a] P, B [e] P, dan 3-methylcholanthrene.
BAHAN DAN METODE
Kultur jaringan media, α-minimal esensial media, serum janin sapi, gentamycin, geneticin (G418), dan Lipofectin tersebut dibeli dari Life Technologies, Inc Kode sumber dari bahan-bahan lain: [α-32P] dATP dari ICN biokimia (Irvine , CA); [3H] B [a] P (60 Ci / mmol) dari Amersham Corp; [3H] TCDD (41 Ci / mmol) dari Chem-Syn Science Labs (Lenexa, KS); Immobilon P dari Millipore ( Bedford, MA); S & S mentransfer membran dari Schleicher & Schuell (Keene, NH); BM Chemiluminescence blotting Barat kit dari Boehringer Mannheim Biochemica Corp (Indianapolis, IN); Tris, TEMED, Tween 20, B [a] P, B [ e] P, 3-methylcholanthrene, TCDD, Isositrat dehidrogenase, nikotinamida, ethoxyresorufin, dan resorufin dari Sigma. Ah reseptor yang mengandung plasmid cDNA ini baik yang disediakan oleh Dr Chris Bradfield (University of Wisconsin).
GNMT cDNA ini disintesis oleh RT-PCR metodologi dari hati tikus poli (A) + RNA persiapan. GNMT spesifik yang maju dan reverse primer adalah
5'-GAGCCAGCTAGCGTCAGGATGGTGGAC dan
5' TGGGAGCTCGAGCCAGGCTCAGCCTGT, masing-masing. Produk ini selanjutnya dimurnikan dengan gel agarosa electophoresis, dan urutan ini ditunjukkan untuk menjadi identik dengan diterbitkan GNMT cDNA. Dua kloning NheI andXhoI situs untuk dimasukkan ke dalam daerah di noncoding cDNA GNMT oleh metodologi PCR. Yang disucikan DNA beruntai ganda Produk ini diligasi ke NheI / XhoI-dicerna pMAMneo (CLONTECH, Palo Alto, CA). Plasmid membangun, pMAMneo / GNMT, berisi GNMT masukkan dari ukuran yang sesuai dalam arti orientasi seperti yang ditentukan oleh urutan pembatasan pencernaan dan tekad. DNS transfectants didirikan menggunakan DNA dari plasmid pMAMneo orangtua. Pada hari 1, DNA mengandung menengah digantikan oleh standar pertumbuhan serum-termasuk menengah, dan inkubasi dilanjutkan untuk tambahan 48 h. Pada hari 4, sel-sel ditempatkan dalam medium yang mengandung pilihan geneticin (0,4 mg / ml). Klon sel tunggal yang dipetik, ditanam di medium seleksi, dan diuji untuk GNMT ekspresi melalui Western blotting dan B [a] P kegiatan mengikat.
Aktivitas mengikat tertentu dinilai oleh gradien sukrosa analisis seperti yang dijelaskan sebelumnya (25). Secara singkat, 100.000 × g supernatant fraksi (0,5-1 mg protein) telah diinkubasi dengan 10 nm [3H] B [a] P atau [3H] TCDD selama 1 jam pada 4 ° C dan 2 jam pada suhu kamar, masing-masing, dengan atau tanpa kelebihan 200-kali lipat dari unlabeled ligan.
4 S PAH-binding protein diidentifikasi sebagai GNMT berdasarkan beberapa kriteria termasuk pemurnian, pengurutan, immunoprecipitation dari aktivitas mengikat PAH poliklonal antibodi untuk GNMT, dan copurification dari dua protein dalam berbagai sel dan jaringan. Penelitian ini dirancang untuk memperkenalkan GNMT gen ke dalam sel yang tidak memiliki kemampuan untuk mengekspresikan protein ini serta reseptor Ah. Sel-sel ini kemudian akan menyediakan model biologis yang cocok untuk menguji induksi oleh PAHs seperti B [a] P dan 3-methylcholanthrene. Hasil studi ini memberikan informasi langsung tentang peran fungsional sebagai GNMT PAH-binding protein yang dapat menengahi ofCYP1A1 induksi. Dalam penyelidikan sekarang, secara stabil GNMT ini diperkenalkan ke CHO (D422) sel-sel, yang tidak memiliki ekspresi endogen protein ini serta reseptor Ah, dengan menggunakan plasmid yang berisi virus Moloney ulangi terminal lama sebagai promotor dan dipamerkan neomisin perlawanan sebagai penanda seleksi. Jika hipotesis GNMT, i.e. 4 S PAH-binding protein, sebagai mediator dari PAH-induksi ekspresi CYP1A1 berlaku, sistem sekarang harus menanggapi B [a] P dalam cara yang sesuai. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa pengenalan ekspresi GNMT ke sel CHO ini pada kenyataannya tidak menyebabkan PAH-induksi ekspresi CYP1A1. Selanjutnya, penafsiran ini diperkuat oleh tidak adanya tingkat dideteksi Ah reseptor dalam baris sel ini. Kami juga telah tidak dapat mendeteksi setiap mRNA untuk Ah reseptor pada orangtua, vektor-berubah, atau pMAMneo / GNMT-sel berubah (data tidak ditampilkan), juga telah kami mendeteksi setiap TCDD mengikat mengikat dan kegiatan XRE dibuktikan dalam sel-sel ini.
GNMT memiliki pengikatan nukleotida daerah dan telah diterjemahkan dalam inti hati tikus oleh berbagai teknik imunohistokimia. GNMT juga telah diusulkan sebagai ekspresi gen modulater oleh metilasi dari substrat yang belum teridentifikasi. Bisa dibayangkan bahwa GNMT dapat bertindak secara tidak langsung dalam modulasi B [a] P-induksi CYP1A1 oleh ungkapan yang tidak dikenal methylating substrat yang dapat mempengaruhi gen ini, karena hypermethylation telah ditunjukkan oleh banyak laboratorium untuk mempengaruhi aktivitas gen.
GNMT adalah mengikat protein yang menjadi perantara induksi CYP1A1 oleh Ah reseptor-jalur independen. Penyelidikan tambahan diperlukan untuk lebih memahami faktor-faktor yang mengatur jumlah dan karena itu dimer GNMT mengendalikan ekspresi CYP1A1.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar